食品致病菌污染是嚴(yán)重威脅人類健康的問題，用于快速、準(zhǔn)確控制食品質(zhì)量的生物傳感器得到了廣泛的研究。

       建立了基于多參數(shù)表面等離子體共振(MP-SPR)生物傳感器檢測乳制品中鼠傷寒沙門菌的方法。利用生物催化沉淀法進一步改進了利用捕獲抗體直接檢測細菌的方法。對照樣品的檢出限(LOD)為10² CFU/mL， 真實樣品(奶粉)的檢出限10³ CFU/mL，表明該生物傳感器具有較高的靈敏度。

概述

       目前使用的沙門氏菌檢測方法包括培養(yǎng)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 。這些方法通耗時，需要復(fù)雜的樣品預(yù)處理和訓(xùn)練有素的人員，因此正在積極開發(fā)更強大和易于使用的方法。

       表面等離子體共振(SPR)是一種成熟的方法，用于測量結(jié)合親和力和動力學(xué)。創(chuàng)新的多參數(shù)表面等離子體共振(MP-SPR)儀器可以在非常寬的角度范圍(40-78度)和多個波長進行測量，從而允許從小分子相互作用到細菌，細胞和病毒的實時檢測的廣泛應(yīng)用。

       MP-SPR是生物傳感器開發(fā)的無與倫比的方法，無論您的傳感器是基于MP-SPR檢測還是您正在開發(fā)新的便攜式(護理點)生物傳感器。MP-SPR的優(yōu)點是靈敏度高，無標(biāo)記檢測。它還允許直接在您選擇的材料上開發(fā)傳感器:金屬電極電化學(xué)、孔板分析用塑料、印刷生物傳感器用纖維素、傳統(tǒng)化學(xué)用玻璃、SERS納米粒子等，避免分析轉(zhuǎn)移步驟。傳感器載片可以很容易地在原位和非原位進行修改，提供了廣泛的功能化可能性(CVD, ALD，自旋涂層，浸漬涂層等)。此外，MP-SPR允許測量真實樣品(牛奶，100%血清，尿液，海水等)，不像許多傳統(tǒng)的SPR儀器。在MP-SPR測量后，可以用AFM等其他方法進一步表征傳感器表面。這得益于MP-SPR的無油操作，使用了涂有光學(xué)彈性體的棱鏡。

材料和方法

       本研究采用BioNavis MP-SPR Navi?210 VASA儀器，流速為20 μL/min。用2 M NaCl和10 mM NaOH溶液清洗CMD3D傳感器載玻片5分鐘，然后用EDC (200 mM)和NHS (50 mM)的混合物活化羧基7分鐘。引入捕獲抗體(和BSA作為參考通道)(10 μg/mL，在50mM醋酸緩沖液中，pH 4.5)，然后用乙醇胺(1 M, pH 8.5, 5分鐘)阻斷剩余的反應(yīng)基團。為了進一步阻斷，注射牛血清白蛋白(2 mg/mL, HBS-P)和1%奶粉，HBS-P。

       將奶粉(Laktino)用HBS-P緩沖液稀釋至1%的濃度。不同濃度的腸沙門氏菌(亞種)。經(jīng)培養(yǎng)和熱處理(80°C/30min)后加入樣品中。處理過的細菌濃度以CFU/mL表示，對應(yīng)于處理前的活細胞。

       細菌注射10分鐘，然后注射10分鐘辣根過氧化物酶抗體偶聯(lián)物(HRP- ab2)和沉淀底物溶液(HRP)(圖1)。生物催化反應(yīng)將4-氯-1-萘酚轉(zhuǎn)化為不溶性苯并4-氯環(huán)己二酮。檢測限(LOD)是根據(jù)信噪比來評估的，其中可測量的最小信號電平必須比噪聲電平高三倍。

圖1所示。多參數(shù)表面等離子體共振(MP-SPR)檢測奶粉中沙門氏菌。辣根過氧化物酶抗體2 (HRP-Ab2)特異性結(jié)合沙門氏菌和沉淀物的形成。

結(jié)果和討論

       該生物傳感器首先在Biacore 3000 SPR儀器上開發(fā)，LOD達到10⁴ CFU/mL。為了進一步改進生物傳感器，選擇了生物催化沉淀反應(yīng)來提高靈敏度。然而，辣根過氧化物酶需要使用乙醇。Biacore儀器與醇不兼容，不像BioNavis MP-SPR儀器，它對有機溶劑具有優(yōu)異的抵抗力。因此，選擇MP-SPR Navi?210A VASA進行進一步研究。

       利用MP-SPR儀器，成功開發(fā)了一種生物傳感器，生物催化沉淀將沙門氏菌檢測限(LOD)從10⁴ CFU/mL提高到10² CFU/mL(圖2)。在含有捕獲抗體和細菌的通道中，結(jié)合水平很高，而在參比通道(處理過的BSA)中僅形成少量沉淀。沙門氏菌結(jié)合多個HRP-Ab2偶聯(lián)物，隨著微生物濃度的增加，生物傳感器的靈敏度呈指數(shù)級提高。與直接結(jié)合法相比，HRP-Ab2結(jié)合物對沙門氏菌具有特異性，也提供了更高的選擇性。該傳感器與革蘭氏陰性菌大腸桿菌K-12的交叉反應(yīng)性測試表明，其結(jié)合可忽略不計。以MP-SPR傳感器載玻片的光學(xué)顯微鏡和AFM圖像為參照，均證實生物傳感器表面有細菌附著和沉淀形成(圖3)。

圖2。沙門氏菌的檢測是基于抗體(HRP-Ab2)與細菌的結(jié)合和辣根過氧化物酶的生物催化沉淀。幾個HRP-Ab2結(jié)合在一個細菌上導(dǎo)致信號呈指數(shù)級擴增。

圖3。緩沖液中不同濃度細菌引起的生物催化沉淀(上圖)和實際樣品奶粉中的細菌檢測(下圖)。原子力顯微鏡圖像證實了細菌附著和沉淀物的形成。

       MP-SPR的總分析時間為60分鐘，明顯短于其他細菌檢測方法，如培養(yǎng)(~d)、ELISA (~10 h)和PCR (~h)。

       細菌的結(jié)合不僅對生物傳感器的發(fā)展很有意義，而且對材料科學(xué)也很有意義。MP-SPR已被用于表征功能性“自衛(wèi)”抗菌植入物涂層(Cado et al.， 2013)。涂層通過病原體刺激釋放抗微生物肽。在這里，MP-SPR測量多層膜的形成并量化吸附質(zhì)量。

結(jié)論
       MP-SPR是一種高靈敏度、高選擇性的生物傳感器，可用于檢測食品樣品中的細菌。例如，MP-SPR對于食品和飼料安全、環(huán)境安全、臨床診斷、邊界和過程控制等方面的檢測開發(fā)具有不可估量的價值。在生物傳感器開發(fā)中使用MP-SPR的主要好處是: 與有機溶劑的相容性，易于修改傳感器表面，能夠處理原始樣品。