細胞外囊泡(EVs)作為潛在的治療方法、藥物輸送系統(tǒng)和疾病(如癌癥)的非侵入性診斷被廣泛研究。探討多參數(shù)表面等離子體共振(MP-SPR)儀器在卵巢癌早期檢測中的應(yīng)用：將腫瘤ev (SKOV-3)負載到表面固定化的LXY30肽上，基于MP-SPR測量，確定了相互作用的親和常數(shù)、動力學(xué)常數(shù)、束縛質(zhì)量和層厚。LXY30肽對表達α3β1整合素的ev具有高親和力，為其診斷應(yīng)用提供了可能。

簡介

       細胞外囊泡(EVs)是由人體細胞釋放到體液中的納米級膜囊泡。眾所周知，它們在向周圍細胞傳遞信號和促進細胞間甚至與遠處細胞的通信方面發(fā)揮著重要作用。ev反映了親本細胞的組成和狀態(tài)，因此可以潛在地用作多種疾病(如癌癥)的標志物。ev的膜特征可以通過整合素(跨膜糖蛋白)來表示，它影響細胞粘附、炎癥、血栓形成和轉(zhuǎn)移。特異性整合素在某些腫瘤細胞中過度表達，產(chǎn)生特征組合，因此是癌癥診斷(檢測)和治療應(yīng)用(即阻斷整合素以減少轉(zhuǎn)移)的有趣靶點。卵巢腫瘤細胞及其分泌的細胞外囊泡表達α3β1整合素。這種特殊的整合素可以被一種環(huán)狀非肽LXY30靶向，LXY30已被開發(fā)用于檢測ev。

       通常，電動汽車的特點是各種技術(shù)需要標簽和使用端點分析方法，而這些方法不能提供實時信息。然而，引入標簽可能會改變顆粒的生化結(jié)構(gòu)，從而影響結(jié)果。MP-SPR是一種實時、無標簽、靈敏度極高的方法，可測量動態(tài)流動條件下的物理化學(xué)現(xiàn)象。因此，它可以被認為是表征細胞外囊泡相互作用的一種極好的方法。

       經(jīng)過驗證的表面等離子體共振(SPR)檢測方法廣泛應(yīng)用于不同的生物傳感器研究，如評估分子相互作用的親和力和動力學(xué)以及生物分子濃度的測定。多參數(shù)表面等離子體共振(MP-SPR)是研究多種靶標的良好平臺。MP-SPR獨特的光學(xué)配置使分析從小分子和抗體到納米顆粒，甚至整個活細胞。特殊光學(xué)與強大的流體設(shè)置相結(jié)合，使MP-SPR不僅可以評估純化樣品，還可以評估粗樣品，如牛奶，海水，血漿，血清和唾液。這些特點與生物傳感器的發(fā)展密切相關(guān)，可用于生命科學(xué)領(lǐng)域的研究。

       特別的是，MP-SPR不僅提供了相互作用的親和力和動力學(xué)，還提供了同一實驗中有關(guān)層性質(zhì)和吸附質(zhì)量的信息。由于測量是在一個非常寬的角度范圍(40-78度)和在一個以上波長的光，厚度和折射率沉積層可以評估。

材料和方法

       在MP-SPR實驗之前，BioNavis標準金傳感器載玻片被非原位涂覆一層自組裝的生物素化烷烴硫醇(11-巰基-1-十一醇，MuOH)單層(SAM)。進入儀器后，在運行緩沖液TRIS-EDTA (25 mM TRIS, 1mM EDTA, pH 8.0)中設(shè)置基線信號，然后在兩個通道中注射鏈霉親和素。生物素化LXY30肽僅在一個通道中引入，留下第二個通道作為參考，不含肽。從最低濃度到最高濃度(3.4 × 10⁹、5.7 × 10⁹和1.7× 10¹⁰顆粒/ml)順序注射，將卵巢癌細胞外囊泡SKOV-3加載到兩個通道中。使用TraceDrawer?for MP-SPR Navi?和MP-SPR Navi?LayerSolver對數(shù)據(jù)進行分析。

結(jié)果和討論

      成功地從癌細胞培養(yǎng)上清中提取了細胞外囊泡，并對其進行了表征，以確認分離過程的成功。通過納米顆粒跟蹤分析(NTA)，細胞外囊泡的濃度為1.70±0.11 × 10¹³個/ml，大小分布為177±87 nm。

      通過MP-SPR確定表面結(jié)合肽(LXY30)與流動的細胞外囊泡(SKOV-3)的相互作用(圖1)。使用TraceDrawer?軟件的“兩位點”結(jié)合模型分析相互作用，將其解釋為兩組肽分子與一個細胞外囊泡結(jié)合。本文對三種假設(shè)的電動汽車進行了評估，其中表面α3β1整合素的含量被評估為每顆?？偟鞍椎?%，5%或10%。所有三個病例的親和力表明SKOV-3顆粒與表面結(jié)合的LXY30配體的強結(jié)合(圖2，表1)。在本研究中，僅測量了三種濃度的分析物，然而，通常建議測量五種或更多濃度來評估親和力和動力學(xué)。

      圖1：細胞外囊泡與非肽的結(jié)合用于卵巢癌的早期檢測。

      圖2：使用TraceDrawer?對MP-SPR Navi?測定肽-細胞外囊泡相互作用的親和力和動力學(xué)常數(shù)。黑色實線表示測量數(shù)據(jù)，橙色虛線表示連續(xù)注射α3β1整合素覆蓋率分別為A) 1%， B) 5%和C) 10%的三種不同種群的電動汽車的傳感圖擬合。

表1：SKOV-3顆粒與LXY30肽結(jié)合的親和力和動力學(xué)常數(shù)。

       通過在LayerSolver?軟件中擬合完整的SPR曲線來評估吸附EV層的厚度和折射率(RI)(圖3)。分析基于670和758 nm激光源提供的MP-SPR的多波長測量。表面結(jié)合的電動汽車的表面質(zhì)量密度估計為90 ng/cm²。EV層的折射率為1.341，略高于PBS等緩沖水溶液的折射率?；贛P-SPR計算的外泌體層厚度僅為34 nm，而基于NTA的平均粒徑為177±87 nm。這可能是因為MP-SPR提供了測量區(qū)域的平均厚度，而電動汽車在傳感器上的分布不均勻。較低的厚度值很可能是由于結(jié)合在表面的外泌體之間的空隙造成的。此外，由于結(jié)合引起的ev形狀變形可能解釋了觀測到的較低的厚度值。

圖3：利用LayerSolver軟件分析SKOV-3細胞外囊泡吸附前后的全MP-SPR曲線，求解顆粒層厚度和折射率。進行了多波長分析，但為了表達清晰，這里只給出了670 nm的測量曲線。

結(jié)論

      MP-SPR已被證明是表征細胞外囊泡相互作用的良好平臺，如本例所示。單個MP-SPR測量提供了幾個數(shù)值，如親和和動力學(xué)常數(shù)、厚度、折射率和吸附質(zhì)量，而實驗是在無標記的方式下進行的。這里提出的方法不僅限于細胞外囊泡，而且適用于其他類型的納米顆粒，包括聚合物和金屬納米顆粒。使用各種樣品、表面和基質(zhì)的可能性使MP-SPR成為生物傳感器開發(fā)和生命科學(xué)研究的杰出平臺。