簡介

       人血清白蛋白(HSA)是血漿中最重要的蛋白質(zhì)，其含量豐富。HSA的主要功能是攜帶脂肪酸和維持血液膠體滲透壓，是許多激素和藥物尤其是疏水藥物的重要載體。藥物與HSA結(jié)合增加了藥物的半衰期，降低了血液中游離藥物的濃度，對(duì)臨床護(hù)理具有極其重要的意義。在藥物發(fā)現(xiàn)早期，確定血漿蛋白結(jié)合是很重要的，因?yàn)樗糜谠u(píng)估藥物的劑量需求和從體內(nèi)的清除。

材料和方法

      羧基甲基葡聚糖(CMD)包被的傳感器載玻片通過胺偶聯(lián)化學(xué)固定HSA(圖2)。固定在21°C下進(jìn)行，使用5 mM MES (2-(N-morpholino)乙磺酸)pH 5.0作為運(yùn)行緩沖液。表面用EDC/NHS活化，用5mM乙醇胺(pH 8.0)滅活。

      采用SPR Navi 220A型儀器測定小分子藥物吲哚美辛、奎尼丁和萘普生(357.8、324.4和230.3 g/mol)與固定化HSA的相互作用。實(shí)驗(yàn)采用pH為7.4的PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)作為運(yùn)行緩沖液，溫度為21℃。測量5個(gè)樣品濃度系列(0.1 ~ 50 μM)?？岫∈禽^弱的結(jié)合劑，因此測定了較高的濃度(10 ~ 500 μM)。樣品中含有3%的二甲基亞砜(DMSO)，以提高藥物的溶解度。用TraceDrawer分析了反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)和親和性。

結(jié)果和討論

       根據(jù)BioNavis固定方案，成功重復(fù)多次固定化HSA。傳感器表面固定HSA的平均量為2000 ng/cm²。通過MP-SPR測量，成功測定了三種小分子量藥物對(duì)HSA的穩(wěn)態(tài)親和力和結(jié)合動(dòng)力學(xué)(表1)。吲哚美辛的親和力圖和動(dòng)力學(xué)分析如圖3和圖4所示。分別測定兩次奎尼丁的結(jié)合度，得到的等結(jié)合值證實(shí)了結(jié)果的重復(fù)性。

結(jié)論

      MP-SPR儀器是測量小分子直接親和力的優(yōu)良工具。通過儀器的實(shí)時(shí)和無標(biāo)簽測量，不僅可以有效地確定結(jié)合的穩(wěn)態(tài)，還可以有效地確定結(jié)合的動(dòng)力學(xué)。這些類型的測量可用于臨床前藥物篩選和生化藥物開發(fā)。