評(píng)估t細(xì)胞對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的特異性對(duì)于開(kāi)發(fā)針對(duì)癌癥的個(gè)性化免疫療法至關(guān)重要。應(yīng)用多參數(shù)表面等離子體共振(MP-SPR)技術(shù)表征腫瘤特異性CD8+ t細(xì)胞中t細(xì)胞受體(TCR)的相互作用。完整的活細(xì)胞被捕獲到由肽-主要組織相容性復(fù)合物(pMHC)功能化的人造細(xì)胞膜組成的仿生表面上。在4個(gè)不同的t細(xì)胞群體中完成了TCR和pMHC之間免疫突觸形成的實(shí)時(shí)親和分析。

簡(jiǎn)介

       表面等離子體共振(SPR)是一種成熟的技術(shù)，用于實(shí)時(shí)和無(wú)標(biāo)記地測(cè)量結(jié)合親和力和動(dòng)力學(xué)。多參數(shù)表面等離子體共振(MP-SPR)儀器可以在寬角度范圍(40-78度)和多個(gè)波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)量，從而能夠評(píng)估從小分子到活細(xì)胞的各種相互作用。該技術(shù)可用于各種創(chuàng)新應(yīng)用，例如表征與活細(xì)胞的相互作用(在傳感器上培養(yǎng)或在流動(dòng)中捕獲)，以及確定生物層的厚度，包括脂質(zhì)雙層和生物材料的構(gòu)象變化。

       t細(xì)胞在人體免疫防御系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，它們的激活引發(fā)了適應(yīng)性免疫反應(yīng)。t細(xì)胞在tcr與抗原肽相互作用時(shí)被激活，抗原肽由腫瘤細(xì)胞或抗原提呈細(xì)胞中的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)呈現(xiàn)。腫瘤相關(guān)抗原特異性免疫細(xì)胞具有增強(qiáng)的抗腫瘤活性，為癌癥個(gè)性化免疫治療的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。這種創(chuàng)新療法旨在激活腫瘤特異性t細(xì)胞，幫助患者自身免疫系統(tǒng)攻擊癌細(xì)胞。成功的免疫治療需要可靠的TCR-pMHC結(jié)合參數(shù)來(lái)評(píng)估治療的特異性和安全性。

材料和方法

       使用MP-SPR Navi?210A VASA儀器進(jìn)行測(cè)量，配備3種激光波長(zhǎng)(每個(gè)流通道分別為670、785和980 nm)。Krebbs EDTA緩沖液流速為10 μl/min，測(cè)量溫度為16℃。

       基于細(xì)胞的檢測(cè)采用3種不同的傳感器格式(圖1):1. 金包覆聚乙二醇化烷硫醇(SAM -自組裝單層)；2. 負(fù)載脂質(zhì)雙分子層(SLB)表面功能化SiO₂；3. 金包覆雜化雙層膜(HBM)。

       所有3層都用生物素修飾，通過(guò)鏈霉親和素介導(dǎo)的結(jié)合，使生物素- pmhc復(fù)合物(裝載NY-ESO-I157?165抗原的HLA-A0201單體)固定化。以PEG-SAM表面為參照，以功能性SLB和HBM為仿生平面基質(zhì)，測(cè)定t細(xì)胞受體結(jié)合情況。

       將人腫瘤特異性CD8+ t細(xì)胞以10² ~ 10⁵個(gè)/mL的細(xì)胞密度注射25 min后加載到細(xì)胞表面。注射后時(shí)間設(shè)置為10分鐘。連續(xù)注射增加細(xì)胞密度的4種不同細(xì)胞群，其中WT(野生型)，DMβ和V49I是不同的TCR變體，而T1φ作為陰性對(duì)照。

結(jié)果和討論

       基于脂質(zhì)的傳感器表面在原位生成，并用專(zhuān)用的LayerSolver?軟件表征層的形成。SLB膜的厚度為5.65 nm, HBM層的厚度為1.95 nm下層的烷硫醇SAM，實(shí)際脂質(zhì)亞層的厚度為2.88 nm。三種激光波長(zhǎng)下SLB沉積的MP-SPR曲線及擬合如圖3所示。與聚乙二醇化的SAM表面相比，SLB和HBM表現(xiàn)出更好的細(xì)胞檢測(cè)靈敏度和更高的特異性細(xì)胞捕獲水平。

       對(duì)所有被測(cè)試的細(xì)胞群進(jìn)行t細(xì)胞與pMHC功能化表面結(jié)合的實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)分析。二維結(jié)構(gòu)解離動(dòng)力學(xué)證明了三種腫瘤特異性CD8+ t細(xì)胞(WT, DMβ， V49I)的不同親和力。表1給出了兩種仿生表面上不同CD8+ t細(xì)胞變體的TCR與pMHC復(fù)合物結(jié)合的動(dòng)力學(xué)值。獲得的數(shù)據(jù)與之前發(fā)表的計(jì)算機(jī)研究一致。DMβ t細(xì)胞特異性結(jié)合pMHC見(jiàn)圖4a。陰性對(duì)照T1φ t細(xì)胞未與pMHC結(jié)合(圖4b)。本文所描述的方法在t細(xì)胞群體的原位檢測(cè)和使用MP-SPR技術(shù)的結(jié)合親和力表征方面表現(xiàn)出出色的特異性和選擇性。

結(jié)論

      在本研究中，在傳感器表面生成仿生SLB和HBM層，并通過(guò)MP-SPR確定層的厚度。不同變體的腫瘤特異性CD8+ t細(xì)胞被成功捕獲到pMHC功能化的表面上，并測(cè)量了TCR對(duì)pMHC復(fù)合物的結(jié)構(gòu)親和力?；贛PSPR的方法已被證明是測(cè)定膜受體抗腫瘤活性的有效工具，并可能加快癌癥免疫治療的發(fā)展步伐。BioNavis儀器可以在生理相關(guān)條件下、可控溫度(15 ~ 45℃)、靜態(tài)或動(dòng)態(tài)流動(dòng)條件下進(jìn)行基于細(xì)胞的測(cè)量。因此，MP-SPR技術(shù)是基于活細(xì)胞的檢測(cè)的有力工具，對(duì)于開(kāi)發(fā)新的細(xì)胞療法和生物材料至關(guān)重要。