采用多參數(shù)表面等離子體共振(MP-SPR)儀器可以測(cè)定牛奶和乳基嬰兒配方奶粉中蛋白質(zhì)的濃度。α-乳清蛋白(ALAB)是嬰兒重要的營(yíng)養(yǎng)蛋白，免疫球蛋白G (IgG)是二次免疫應(yīng)答的重要組成部分。根據(jù)校準(zhǔn)曲線確定未知樣品的濃度。該試驗(yàn)是使用固定在表面的抗alab抗體或抗igg抗體的直接結(jié)合試驗(yàn)。同樣的分析格式可用于檢測(cè)其他類似的感興趣的蛋白質(zhì)，如抗生素殘留、毒素、過(guò)敏原或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

簡(jiǎn)述

       α-乳清蛋白(α-Lactalbumin, ALAB)是母乳中含量最多的乳清蛋白，對(duì)哺乳嬰兒具有重要的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。作為人源化過(guò)程的一部分，ALAB經(jīng)常被添加到從牛奶中提取的嬰兒配方奶粉中，它也可以用作低過(guò)敏性嬰兒配方奶粉中水解的標(biāo)記物。這使得牛奶中完整蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確濃度測(cè)定成為主要的研究對(duì)象。

       牛奶中的IgG對(duì)人類致病性細(xì)菌具有特異性活性。牛奶中抗微生物因子的濃度對(duì)原料奶的保質(zhì)期有影響，并可能提供額外的健康益處。

       多參數(shù)表面等離子體共振(MP-SPR)是構(gòu)建復(fù)雜基質(zhì)(如牛奶)免疫濃度測(cè)定的良好平臺(tái)。成熟的SPR檢測(cè)方法廣泛應(yīng)用于不同的免疫學(xué)研究，如抗體生產(chǎn)和生物制藥藥物開發(fā)中的動(dòng)力學(xué)、親和力和濃度測(cè)定。MP-SPR技術(shù)強(qiáng)大的流體設(shè)置和獨(dú)特的光學(xué)配置可以對(duì)牛奶、海水、血漿、血清和唾液等粗樣品進(jìn)行分析。

材料和方法

       牛奶中ALAB和IgG定性濃度測(cè)定的直接檢測(cè)方法改編自H. Indyk(2009)。測(cè)量使用全自動(dòng)四通道MP-SPR Navi?420A ILVES儀器和BioNavis CMD-3D傳感器載玻片進(jìn)行。固定化方法為標(biāo)準(zhǔn)氨基偶聯(lián)，包括活化NHS和EDC、蛋白偶聯(lián)和CMD表面的乙醇胺失活。ALAB檢測(cè)采用多克隆抗ALAB抗體(Bethyl Labs A10-128A)， IgG檢測(cè)采用多克隆抗IgG抗體(Jackson ImmunoResearch 301-005-003)。校正標(biāo)準(zhǔn)為ALAB (Sigma-Aldrich L6010, 14 kDa)和牛IgG (Jackson ImmunoResearch 001-000-003, 150 kDa)。ALAB用HBS+T (Hepes緩沖鹽水，含0.05% Tween 20)， IgG用PBS+T(磷酸鹽緩沖鹽水，含0.05% Tween 20)。分析物再生液為10 mM甘氨酸- hcl pH 2。使用TraceDrawer?for BioNavis v. 1.8分析數(shù)據(jù)。

       樣品是從芬蘭超市購(gòu)買的不同的奶制品(圖1)。粉末樣品根據(jù)包裝上的說(shuō)明制備成液體形式，并進(jìn)一步稀釋1000或50倍(正常牛奶)和5000倍(嬰兒產(chǎn)品)。使用90秒的樣品注射(校準(zhǔn)或牛奶樣品)，120秒的等待時(shí)間和60秒的ALAB再生注射進(jìn)行測(cè)量。IgG注射時(shí)間較長(zhǎng)。ALAB的校準(zhǔn)范圍為0 - 1000 ng/mL, IgG的校準(zhǔn)范圍為0 - 75 000 ng/mL。校正曲線符合4參數(shù)Low-High方程，也可用于測(cè)定樣品中的蛋白質(zhì)濃度。

結(jié)果和討論

      抗alab和抗igg抗體成功固定在CMD傳感器表面。參考校正后的蛋白檢測(cè)感圖為典型的抗體-抗原相互作用曲線(圖2)。校準(zhǔn)濃度形成典型的校準(zhǔn)圖。ALAB樣品在校準(zhǔn)曲線上的位置相對(duì)均勻，而IgG濃度在所研究的乳制品中沒有顯示出太大的差異。ALAB和IgG濃度計(jì)算結(jié)果見表1和表2。

      在低過(guò)敏性奶粉配方(S3和S5)中幾乎沒有檢測(cè)到ALAB蛋白。這是預(yù)料之中的，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)已經(jīng)被熱水解，因此假定沒有完整的ALAB保留下來(lái)。正常牛奶(S1)中ALAB的濃度最低，這也是意料之中的結(jié)果，因?yàn)锳LAB通常只是出于營(yíng)養(yǎng)原因添加到嬰兒配方奶粉中。

結(jié)論

       MP-SPR是用免疫分析法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的一個(gè)極好的平臺(tái)。當(dāng)使用高親和力抗體時(shí)，該方法的靈敏度可輕松達(dá)到ng/mL。本文提出的方法也可用于其他乳蛋白，如β-乳球蛋白。MP-SPR不僅限于牛奶作為測(cè)量基質(zhì)，還可用于其他與食品相關(guān)的基質(zhì)，如果汁和洗脫的小麥粉，或其他粗樣品，如100%血清、尿素和海水。